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Chloroplasten

Isolation of Chloroplasts from Spinach Leaves

Chloroplasts are isolated from spinach leaves with a procedure leaving the outer membrane intact. It is important to work on ice, because during the procedure proteolytic enzymes were released. The harmful effect of these enzymes will be reduced by coldness as well as speed of preparation. Chloroplasts are extremely light labile. They should be kept cool and in reduced light at all times, except when actually being used for analysis of photosynthesis. Once diluted, the chloroplasts will be reasonably unstable and you should work as rapidly as possible while keeping all reactants as cool as possible. 
The isolation procedure used here leaves the chloroplast outer membrane intact.

If you wish to study the enzymes for photophosphorylation, wash the chloroplasts and rupture the outer membranes. To rupture the outer membranes, resuspend the chloroplasts in diluted suspension solution (1:25). Immediately centrifuge the chloroplast suspension at 8,000 xg for 5 minutes to collect the broken chloroplasts. Remove the diluted suspension media and resuspend the broken chloroplasts in isotonic media (0.35 M NaCl or undiluted suspension buffer).


Materials:
Grinding solution:
0.33 M Sorbitol, 10 mM Sodium pyrophosphate (Na4P2O7), 4 mM MgCl, 2 mM Ascorbic Acid
Adjust pH to 6.5 with HCl

Suspension solution
0.33 M Sorbitol, 2 mM EDTA, 1 mM MgCl, 50 mM HEPES
Adjust pH to 7.6 with NaOH

Fresh spinach leaves, Chopping board and knife, Chilled mortar and pestle, Cheesecloth (or 100 µm, 60 µm Nylon), Refrigerated preparative centrifuge, Aluminum foil, Ice bucket

Methods:

1. Prepare an ice bath and pre-cool all glassware to be used.
2. Select several fresh spinach leaves and remove the large veins by tearing them loose from the leaves. Weigh out 4.0 grams of deveined leaf tissue.
3. Chop the tissue as fine as possible. Add the tissue to an ice-cold mortar containing 15 ml of grinding solution and grind to a fine paste.
4. Filter the solution through double layered cheesecloth into a beaker and squeeze the tissue pulp to recover all of the suspension.
5. Transfer the green suspension to a cold 50 ml. centrifuge tube and centrifuge at 200 xg for 1 minute at 4° C to pellet the unbroken cells and fragments.
6. Decant the supernatant into a clean centrifuge tube and recentrifuge at 1000 xg for 7 minutes. The pellet formed during this centrifugation contains chloroplasts. Decant and discard the supernatant.
7. Resuspend the chloroplast pellet in 5.0 ml. of cold suspension solution. Use a glass stirring rod to gently disrupt the packed pellet. This is the chloroplast suspension for use in subsequent procedures.
8. Enclose the tube in aluminum foil and place it in an ice bucket.


Auftrennung der Chloroplasten im Percoll-Stufengradient.

Mischen Sie 10 %, 20 %, 30 %, 40%, 50% (v/v) Percoll-Lsg in Suspensionspuffer (2 x konz. Lsg nötig). Schichten sie diese Lösungen in 1000 µl Schritten in einem 6 ml Falcon-Röhrchen (analog etwas mehr in 10 ml Röhrchen) vorsichtig übereinander. Lagern Sie die Gradienten in Eis. Beschichten sie diese Stufengradienten mit einer definierten Menge Chloroplasten in ca. 1 ml. Etwa 30 µg Chlorophyll sind geeignet. Zentrifugieren Sie bei 5000 xg für 20 min bei 4°C.

Sie sollen die Percoll-Konzentration ermitteln, bei der intakte Chloroplasten im Gradienten eine Bande bilden. Das geht auch durch ein Vorexperiment mit 0,5 ml der einzelnen Stufen des Gradienten (Kissen) in Eppendorfgefäßen (u.U. mit mehr Abstufungen) und einem Zentrifugationsschritt bei 9000 xg für 5 min bei 4°C.


Auftrennung der Chloroplasten im kontinuierlichen Percoll-Gradient.

Zwei Gruppen sollen diese Auftrennung auch in einem kontinuierlichen Gradienten realisieren. Dazu benötign sie Gradientenmischer, Rührer, Kapillare und Schlauchpumpen, die die Röhrchen langsam mit aufsteigender oder absteigender Konzentration der Percoll Lösung beschicken, je nach ob, wo die Kapillaröffnung im Röhrchen sich befindet.
Ein Gradientenmischer besteht aus zwei verbundenen Kammern gleicher Art. An einer dieser Kammer befindet sich noch ein Auslauf. Das Gefäß mit Auslauf wird stetig mit einem Rührer durchmischt. Entnimmt man über den Auslauf Lösung, gleichen sich die beiden Kammern über die Verbindung aus und die Konzentration im Auslaufgefäß ändert sich kontinuierlich. Auf diese Weise kann man Gradientenröhrchen gleichmässig beschicken, oder aber auch Stoffe an Säulen (Chromatographie) mit Konzentrationsgefällen im Puffer eluieren, oder aber Gele diskontinuierlich gestalten usw. usf.
 

Chlorophyll-Bestimmung (nach Arnon, 1949)

Diese Bestimmung beruht auf der Tatsache, daß bei 652 nm die Extinktionskoeffizien­ten von Chlorophyll a und b gleich sind, nämlich 34,5 cm2/mg.

0,2 ml der Chloroplastensuspension in ein Zentrifugenglas (Eppi) pipettieren.
0,8 ml 100 % Aceton zufügen und gründlich schütteln.
5 min bei 9.000 x g zentrifugieren.
Den Überstand bei 652 nm gegen 80 % (v/v) Aceton in Glasküvetten (Aceton löst Plastik an wenn nicht auf) photometrisch bestimmen, ggf. mit 80 % Aceton verdünnen, so daß E < 1,0 ist (gründlich mischen!).

Berechnung:  (E652 x 1000)/34,5 = Konzentration in µg Chlorophyll/ml

·     Berechnen Sie aus diesem Wert den Chlorophyllgehalt der ursprünglichen Chloro­plastensuspension (Verdünnungen beachten!)
·     Verdünnen Sie die Chloroplastensuspension so mit Chloroplastenpuffer, daß 1 ml der Suspension 20 bis 30 µg Chlorophyll enthält.

Last modified: 01.09.2005 17:32
Author: Johannes Siemens

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