Methodenspektrum
Table of contents
IM RAHMEN DER GENETISCHEN DIAGNOSTIK BIETEN WIR FOLGENDE METHODEN AN:
NGS-Paneldiagnostik und Exom-Sequenzierung
Bei vielen genetisch bedingten Erkrankungen, die klinisch diagnostiziert werden, wird bislang die ursächliche Genveränderung nicht gefunden, da im Rahmen der klassischen "Gen-für-Gen"-Sequenzierung und der damit verbundenen hohen Kosten sowie des enormen Zeitaufwandes meist nur wenige Gene untersucht werden können. Insbesondere im Bereich der Tumorprädispositionssyndrome (wie dem familiären Brust- und Eierstockkrebs oder dem familiären Darmkrebs) sowie im Bereich der unspezifischen geistigen Entwicklungsverzögerung kommen viele Gene in Betracht, die auf der Suche nach der ursächlichen Mutation zu untersuchen sind.
L. Rossow und F. Stübner (Technische Assistentinnen)
Um auch größere Gengruppen (sogenannte „Gen-Panels“) schnell, gründlich und kostengünstig auf Sequenzebene untersuchen zu können, haben wir die Hochdurchsatzsequenzierung (engl. „Next Generation Sequencing“, NGS) etabliert. Der Begriff "nächste Generation" distanziert dieses Verfahren von der Sequenzierung der ersten Generation, bei der jeder einzelne Lesevorgang ("Read") in einem separaten Reaktionsgefäß stattfindet, hohe Volumina an Reagenzien erforderlich sind und die Sequenziergeschwindigkeit aufgrund der elektrophoretischen Fragment-Auftrennung gering ist. Im Gegensatz hierzu wird beim Sequenzierverfahren der zweiten Generation extrem parallelisiert, extrem miniaturisiert und extrem schnell sequenziert. So erzeugt das von uns verwendete Sequenziergerät "MiSeq" bis zu 1 Million Reads pro Quadratmillimeter Reaktionsoberfläche (⇒Miniaturisierung). Insgesamt werden pro Lauf bis zu 25 Millionen Reads gleichzeitig erzeugt (⇒Parallelisierung) und ein Lauf benötigt je nach Read-Länge etwa 10 Stunden, also etwa 700 Reads pro Sekunde (⇒Geschwindigkeit).
An unserem Institut bieten wir die hochdurchsatzbasierte Sequenzierung von 94 Genen an, die mit einer erhöhten Tumorprädisposition einhergehen (siehe Abbildung 1). Des Weiteren führen wir die Sequenzierung von ca. 4800 Genen durch, die mit genetisch bedingten Erkrankungen assoziiert sind (siehe Abbildung 2).
Abbildung 1: Schematische Darstellung einer Auswahl von Genen, die bei Verdacht auf familiärer Tumorprädisposition mittels Panel-NGS sequenziert werden. In der Bildmitte ist eine mittels NGS identifizierte Rasterschub-Mutation im Gen BRCA1 dargestellt. Frauen mit dieser Mutation haben ein 80 %-iges Risiko, im Laufe ihres Lebens einen Brusttumor zu entwickeln. Das Risiko, aufgrund dieser Mutation einen Eierstockkrebs zu bekommen, liegt bei ca. 40 %.
Abbildung 2: Die gleichzeitige Sequenzierung von über 4800 krankheitsrelevanten Genen ermöglicht es, große Gen-Gruppen, die mit syndromalen und nicht-syndromalen genetischen Erkrankungen assoziiert sind, in einem einzigen Durchgang zu analysieren. In der Abbildung ist exemplarisch nur eine kleine Auswahl der vielen Gengruppen dargestellt, die mit dem 4800-Gen-Panel abgedeckt werden.
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Molekulare Karyotypisierung
A. Käßner-Frensel und E.-M. Gerlach (Technische Assistentinnen)
Submikroskopische Verluste und Zugewinne von Erbgut (DNA) können die Ursache einer genetischen Erkrankung darstellen. Häufig handelt es sich dabei um sogenannte Mikrodeletions- bzw. Mikroduplikationssyndrome. Einige dieser krankheitsauslösenden Veränderungen sind bereits seit Jahrzehnten bekannt. Bevor die molekulare Karyotypisierung als Analysemethode verfügbar war, mussten Mikrodeletionssyndrome klinisch erkannt und per FISH- Analyse (Fluoreszenz in situ Hybridisierung) bestätigt werden. Durch die molekulare Karyotypisierung ist es nun möglich, das gesamte Erbgut (Genom) mit einer einzigen Analyse auf alle Mikrodeletions- und Mikroduplikationssyndrome hin zu untersuchen. Neben bekannten, krankheitsverursachenden Varianten lassen sich auch bislang unbekannte Ursachen von Erkrankungen finden.
In erster Linie wird diese Untersuchung bei Patienten mit einer Entwicklungsstörung durchgeführt. Grundsätzlich ist sie aber als Methode für alle genetisch bedingten Erkrankungen einsetzbar, die durch Zugewinne oder Verluste von Erbgut verursacht werden.
In unserem Labor wird die molekulare Karyotypisierung in Form einer Array-CGH durchgeführt. Routinemäßig verwenden wir einen 400k-Array der Firma Agilent, der eine mittlere Auflösung von unter 17 kb über das gesamte Genom liefert. Die geforderten 200 kb für eine abrechenbare Leistung werden also um mehr als das Zehnfache übertroffen.
Neben Standardarrays kommen bei uns auch sogenannte Custom-Arrays zum Einsatz, mit deren Hilfe eine Gruppe von Genen untersucht wird, die für bestimmte Erkrankungen relevant sein können, z.B. Tumorsuppressorgene. Mit diesem Verfahren können Varianten gefunden werden, die kleiner als 1 kb sind.
Abbildung 1: Mikroduplikation (A) und Mikrodeletion (B) 16p11.2. Im linken Teil ist das gesamte Chromosom 16 zu sehen, rechts der Ausschnitt mit der betroffenen Region. Beide Varianten sind als Ursache einer Entwicklungsstörung bekannt. Allerdings sind diese auch in nicht betroffenen Personen, z.B. Eltern, zu finden. Eine Vorhersage, wie sich die Veränderung auf eine Person auswirkt, ist nach aktuellem Stand der Wissenschaft nicht möglich.
Abbildung 2: Ideogramme humaner Chromosomen mit einer Auswahl an eingezeichneten Loci oder Genen, die bei Verlust (blau) oder Zugewinn (rot) verantwortlich für syndromale oder nicht syndromale geistige Entwicklungsstörungen sind. (Stankiewicz and Lupski, 2010)
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Konventionelle und Molekulare Zytogenetik
Dr. med. J. Porrmann (Assistenzarzt)
Eine menschliche Körperzelle enthält 46 Chromosomen, in denen die DNA verpackt ist. Männliche Zellen sind durch den Karyotyp 46,XY und weibliche Zellen durch den Karyotyp 46,XX charakterisiert. Veränderungen an den Chromosomen können Entwicklungsstörungen und Fehlbildungen, das Auftreten von Aborten und Fertilitätsproblemen verursachen. Die zytogenetische Diagnostik erfasst die sichtbaren zahlenmäßigen – numerischen - und strukturellen Chromosomenveränderungen in teilungsfähigen Zellen in der Regel nach einer Zellkultivierung.
P. Freitag, C. Mai, A. Käßner-Frensel und A. Richter (Technische Assistentinnen)
Rein methodisch wird die zytogenetische Diagnostik unterteilt in die konventionelle zytogenetische und in die molekularzytogenetische Diagnostik. In der konventionellen zytogenetischen Diagnostik werden mit Bänderungstechniken gefärbte Metaphasechromosomen im Lichtmikroskop analysiert. Hierbei werden alle Chromosomen einer Zelle analysiert. Es wird quasi ein Genom-Screening auf dem Niveau von Metaphasechromosomen durchgeführt.
In der molekularzytogenetischen Diagnostik werden mit Hilfe von fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonden bestimmte Chromosomenregionen bzw. einzelne Chromosomen im Fluoreszenzmikroskop analysiert. Diese Methode wird Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) genannt und stellt eine Kombination aus molekulargenetischen Techniken und Mikroskopie dar. Mit Hilfe der FISH können auch die Chromosomen in der Interphase analysiert werden, z.B. beim „ Pränatalen FISH-Schnelltest“.
Konventionelle zytogenetische Diagostik (postnatal und pränatal)
Die postnatale zytogenetische Diagnostik von Neugeborenen, Kindern oder auch Erwachsenen wird aus den verschiedensten Gründen routinemäßig an Lymphozyten des peripheren Blutes durchgeführt, in seltenen Fällen noch zusätzlich an Hautfibroblasten. Im Rahmen der vorgeburtlichen (präntalen) Diagnostik kann eine zytogenetische Analyse von Fruchtwasserzellen, Chorionzotten oder auch fetalem Blut eine Aussage über die kindlichen Chromosomen geben.
1. Die Chromosomenanalyse erfolgt in der Regel an kultivierten Zellen aus:
- Lymphozyten des peripheren Blutes und Hautfibroblasten ⇒ postnatal
- Fruchtwasser nach Amniozentese, Chorionzotten nach CVS-Biopsie und
Lymphozyten aus Fetalblut nach Cordozentese ⇒ pränatal - aus Abortmaterial
2. Die Bänderungsanalyse des Chromosomensatzes der Metaphasezellen erfolgt mit:
- Routine G-Bänderung und anderen speziellen Färbetechniken
- Spezielle hochauflösende RBG-H Bänderung bei Fragestellungen zur Chromosom Inaktivierung
Molekularzytogenetische Diagnostik (Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung, FISH)
Mit Hilfe von fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonden werden spezifische Chromosomenabschnitte oder einzelne Chromosomen direkt nachgewiesen, z.B. bei der Analyse von submikroskopischen Chromosomenveränderungen, wie Mikrodeletionen und -duplikationen oder beim pränatalen FISH-Schnelltest.
Die FISH-Analyse wird sowohl mit kommerziell verfügbaren DNA-Sonden verschiedenster Hersteller als auch mit selbst hergestellten Sonden durchgeführt.
Kontakt:
© P. Benjamin
Mitarbeiter Genetische Diagnostik
NameMr Dr. rer. nat. Karl Hackmann
Laborleiter Genetische Diagnostik
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