CRISPR/Cas9 und GATEWAY-Cloning
CRISPR/Cas9
Mit Hilfe der CRISPR/Cas9 (Clusteres Regulatory Interspaced Short Palindromic Reapeats)-Technologie werden forschungsinteressante Gene aus dem Bereich Hirnfehlbildungen (AG Dr. med. Nataliya Di Donato) z.B. im Zebrafischgenom gezielt deletiert, beziehungsweise durch Varianten ersetzt, welche den im Patienten gefundenen Mutationen entsprechen.
Auch im Rahmen der Hirntumoreforschung (AG Dr. med. Barbara Klink) wird die inovative Technik CRISPR/Cas9 genutzt. Ziel ist es im Patienten gefundene, Hirntumor assoziierte, Mutationen in Zellkulturen nachzustellen und so deren Einfluss auf die Biologie der Zelle im Allgemeinen und auf verschiedenen Stoffwechselwege im Speziellen zu untersuchen.
GATEWAY-Cloning
Die Methode des GATEWAY-Cloning soll künftig am Institut für Klinische Genetik genutzt werden um zum Beispiel eine gewebsspezifische Überexpression eines "Kandidatengens", in Kombination mit einem Reportergen, im Tiermodell (Zebrafisch) zu erlangen. Dafür soll auf das sogenannte Tol2-System [1] zurückgegriffen werden. Ähnlich einem Bausatz stehen verschiedene Stets von Einzelelementen (Plasmide wie p5E, pME, p3E und pDestTol2pA) zu Verfügung. So kann je nach Wunsch auf unterschiedliche p5E-Plasmide zurückgegriffen werden. Diese enthalten zum Beispiel verschiedene, gewebespezifische Promotoren. Ebenso stehen zahlreiche p3E-Vektoren zur Verfügung, die diverse Reportergene enthalten (z.B. für die Expression von EGFP). Sie sollen im späteren Tiermodell das Screening auf die gewünschten Mutationen erleichtern. Für das GATEWAY-Cloning werden die beschriebenen p5E- und p3E-Plasmide mit zwei weiteren Vektoren kombiniert. Zum einen das pME-Plasmid: Es beinhaltet das Mutation tragende DNA-Segment des zu untersuchenden "Kandidatengens" und wird projektspezifisch neu generiert. Alle drei bisher aufgezählten Plasmide werden zusammen mit dem Zielvektor pDestTol2pA und dem Enzym LR-clonase in einen Reaktionsansatz gegeben. Das Resultat, der darin ablaufenden Rekombinationen, ist ein Vektor, welcher in direkter Abfolge einen gewebespezifischen Promotor, das DNA-Segment für die Überexpression des zu untersuchenden "Kandidatengens", sowie einen Reporter für das Screening im Tiermodell enthält.
[1] Kwan, K.M. et al.: The Tol2kit: A Multisite Gateway-Based Construction Kit for Tol2 Transposon Transgenesis Constructs. Wiley-Liss (2007), doi: 10.1002/dvdy.21343