Adaptive Mikroskopie mit hybrider Beleuchtung
Die Weitfeldmikroskopie ist in biologischen und medizinischen Anwendungen gut etabliert. Aber ihre reduzierte optische Schnittbildung führt zu Hintergrundsignalen, die außerhalb der interessierenden Tiefe entstehen, den Kontrast vermindern und die Auflösung und Aufnahmequalität stark einschränken. Um diese Einschränkung zu lösen, wurden verschiedene mikroskopische Techniken eingeführt, die eine angemessene optische Schnittbildung bieten, wobei die konfokale Mikroskopie die prominenteste ist. Obwohl die konfokale Mikroskopie sehr gute Aufnahmeeigenschaften besitzt, handelt es sich jedoch um eine punktweise Technik und erfordert daher das Scannen in drei Dimensionen, um 3D-Informationen zu erhalten, was zeitaufwändig ist. Die hybride Beleuchtungsmikroskopie ermöglicht Weitfeldmikroskopieaufnahmen mit optischer Schnittbildung, durch Analyse des Ortsfrequenzinhalts des aufgenommenen Bildes. Da bei fokussierten Probenteilen die maximale räumliche Frequenzbandbreite durch das System transportiert wird, führen hohe räumliche Frequenzen, die von der Probe herrühren, bereits zu einem optischen Schnitt. Um Zugang zum niederfrequenten Teil des Fokusbereichs zu erhalten, kann eine strukturierte Beleuchtung verwendet werden, um hohe Ortsfrequenzen künstlich zu erzeugen. Die Kombination aus einer homogenen und einer strukturierten Beleuchtung birgt somit das Potential, Bilder mit optischer Schnittbildung , bei stark reduziertem Scanbedarf über einen größen Bildbereich aufzunehmen. Es ist lediglich nur eine axialer Scan erforderlich. Die Verwendung adaptiver Linsen erlaubt es, jede mechanische Bewegung zu umgehen und einen schnelle axialen Scan zu realisieren, wodurch schnelle volumetrische Aufnahmen ermöglicht werden. Wir verwenden diese Technik zur Analyse der Fluoreszenz von transgenen Zebrafischlarven.
Die Methode eignet sich für alle Fluoreszenzmessungen und ist nicht auf die Weitfeldmikroskopie beschränkt, sondern kann z.B. auch in Lichtscheibenmikroskope integriert werden.
K. Philipp, A. Smolarski, N. Koukourakis, A. Fischer, M. Stürmer, U. Wallrabe, J. Czarske “Volumetric HiLo microscopy employing an electrically tunable lens”, Opt. Express 24(13), 15029-15041 (2016).