Dresdner und Münchner Forscher überwinden Translationslü­cke durch Entwicklung eines neuen in vivo Modells für die Markierung sekretorischer Insulingranula Pools

Die Betazellen der Bauchspeicheldrüse produzieren, speichern und sezernieren bei erhöhtem Blutzuckerspiegel das blutzuckersenkende Hormon Insulin. Allerdings sind bei diesem stark regulierten Prozess der Insulinsekretion, insbesondere die molekularen Merkmale und die diesem Prozess zugrunde liegenden Stimuli, noch nicht vollständig geklärt. Hinzu kommt, dass das derzeitige Verständnis der Betazellfunktion größtenteils aus Studien an isolierten ex vivo Inseln in Nagetiermodellen stammt. Um diese bestehende translationale Lücke zum Menschen hin zu überwinden und den Umsatz der sekretorischen Insulingranula in vivo zu untersuchen, hat ein nationales Forschungsteam unter der Leitung von Wissenschaftlern des Paul-Langerhans-Instituts des Helmholtz Zentrums München am Universitätsklinikum Carl Gustav Carus und der Medizinischen Fakultät der TU Dresden (PLID) und der LMU München ein transgenes Schweinemodell entwickelt, das erstmals die in vivo Fluoreszenzmarkierung von altersdifferenzierten Pools an sekretorischen Insulingranula ermöglicht und damit eine lebensnahe Darstellung des Insulinumsatzes unter normoglykämischen Bedingungen bietet. Die Ergebnisse dieses in enger Zusammenarbeit durchgeführten Projekts wurden jetzt in der renommierten Fachzeitschrift "Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS)" veröffentlicht. Dieses neuartige, menschenähnliche Großtiermodell liefert wahrscheinlich Einblicke in den Umsatz von Insulingranula Pools unter physiologischen und pathologischen Bedingungen, welche dem von Typ-2-Diabetes beim Menschen ähnelt.

Die Funktionsstörung der Betazellen der Bauchspeicheldrüse ist eine der Hauptursachen für Typ-2 Diabetes (T2D), einer Krankheit, von der weltweit mehrere hundert Millionen Menschen betroffen sind. Jede Betazelle speichert Insulin in mehreren tausend Organellen, den so genannten insulinsekretorischen Granula (SG), die Insulin extrazellulär freisetzen, wenn der Blutzuckerspiegel erhöht ist, beispielsweise nach einer Mahlzeit. Bemerkenswerterweise wird aber nur ein kleiner Teil der Insulin SG freigesetzt, und zwar vorzugsweise diejenigen, die erst kürzlich in den Zellen gebildet worden sind. Bisher ist unser Verständnis der Prinzipien, die den Umsatz von Insulin SG steuern, noch sehr rudimentär und stammt ausschließlich aus ex vivo Experimenten mit isolierten Pankreasinseln, z. B. aus genetisch veränderten Mausmodellen, oder aus in vitro Arbeiten mit insulinproduzierenden Zelllinien. Seit kurzem stehen nun auch transgene Schweine zur Verfügung, die es ermöglichen, Betazellforschung in einem Kontext durchzuführen, der dem des Menschen noch näherkommt.

In dieser neuen Studie beschreiben die Forscher die Erzeugung und Charakterisierung eines transgenen Schweinemodells namens SOFIA (Study OF Insulin granule Aging). "Der erste Schritt im Generierungsprozess war die Fusion eines SNAP-Tags an das Insulin-Gen, welches die konditionale und flexible Markierung von altersdefinierten Insulin SG Pools mit verschiedenfarbigen Fluorophoren über längere Zeiträume ermöglicht", erklärt Dr. Elisabeth Kemter aus dem Wolf-Labor am Genzentrum der LMU, eine der Erstautoren der Studie. "Als nächstes mussten wir dann diesen Vektor in Schweinezellen transfizieren. Diese wurden für den somatischen Zellkerntransfer verwendet, um Embryonen zu erzeugen, die dann in estrus-synchronisierte Jungsauen übertragen wurden. Anschließend haben wir das SOFIA-Schwein mit der höchsten INS-SNAP-Expressionsrate in den Betazellen identifiziert, aus welchem wir dann die Schweinelinie für die folgenden Experimente aufgebaut haben."

Mit Hilfe von Immunfärbungen und konfokaler Mikroskopie wiesen die Wissenschaftler die Kolokalisierung von SNAP und Insulin in den Langerhans´schen Inseln nach und bestimmten durch gezielte Locus-Amplifikation (TLA) mit anschließender Next Generation Sequencing (NGS) die genaue Transgen-Integrationsstelle. "Wir haben festgestellt, dass das Transgen an einem einzigen Locus in einer nicht-kodierenden Region auf Chromosom 11 integriert wurde und haben dann die INS-SNAP-Expressionsniveaus und die Lokalisierung auf zellulärer Ebene weiter charakterisiert", sagt Dr. Andreas Müller vom Solimena-Labor am PLID. "Insgesamt kann man festhalten, dass die Ultrastruktur der Betazellen von SOFIA-Schweinen vergleichbar ist mit der von Schweinen, die kein Insulin-SNAP exprimieren. Auch die Insulin SG, Mitochondrien und das endoplasmatische Retikulum erschienen normal, ohne Anzeichen von Stress oder strukturellen Veränderungen. Wichtig ist in diesem Zusammenhang auch, dass die durchgeführten Glukosetoleranztests keinen offensichtlichen Unterschied in der Blutglukosereduktion von SOFIA-Schweinen im Vergleich zu Wildtyp-Schweinen ergaben und die Plasmainsulinspiegel zwischen den beiden Gruppen vergleichbar waren”, so Müller. “Wir konnten anhand der durchgeführten Experimente zeigen, dass die sequentielle Anwendung von zwei SNAP-Farbstoffen unterschiedlicher Wellenlänge zu Insulin SG Pools unterschiedlicher Farbe führte, was uns letztlich ermöglicht, den Insulinumsatz in einer lebensnahen Umgebung zu verfolgen."

Mit der erfolgreichen Erzeugung und Charakterisierung dieses transgenen Schweines hat das Forscherteam einen bedeutenden Schritt zur Überwindung von zwei großen Einschränkungen der derzeitigen Betazellforschung gemacht: der Translationslücke zwischen Nagetieren und Menschen und den ex vivo Experimenten zum Insulinumsatz unter Verwendung isolierter Pankreasinseln. Vor allem der erste Punkt ist von Bedeutung, da das transgene Schweinemodell diese Translationslücke schließt. Dies liegt daran, dass i) Schweine in der Anatomie ihres Magen-Darm-Trakts und der Morphologie und Funktion der Bauchspeicheldrüse dem Menschen ähnlich sind, ii) nachgewiesen wurde, dass die Struktur und Zusammensetzung der Pankreasinseln von Schweinen der des Menschen viel ähnlicher ist als die von Nagetieren, und iii) die molekularen und entwicklungsbedingten Signaturen von Schwein und menschlichen Inseln/Betazellen einander ebenfalls ähnlicher sind als die von Menschen und Nagetieren.

Zusammengefasst ist das Schwein ein überzeugender Modellorganismus nicht nur für die Untersuchung des systemischen Stoffwechsels, sondern insbesondere auch für die Untersuchung der Inselzellen- und Betazellfunktion. Zukünftige Studien werden nun darauf abzielen, die Zufuhr des Markierungsfarbstoffs zu den Betazellen und die Markierung der zu unterschiedlichen Zeiten produzierten Insulin SG zu optimieren. Letztendlich soll das SOFIA-Schwein dann mit anderen zur Verfügung stehenden diabetischen Schweinemodellen gekreuzt werden, um so Einblicke in die Veränderungen des Insulin SG Umsatzes bei T2D zu gewinnen.

Originalpublikation:

Elisabeth Kemter, Andreas Müller, Martin Neukam, Anna Ivanova, Nikolai Klymiuk, Simone Renner, Kaiyuan Yang, Johannes Broichhagen, Mayuko Kurome, Valeri Zakhartchenko, Barbara Kessler, Klaus-Peter Knoch, Marc Bickle, Barbara Ludwig, Kai Johnsson, Heiko Lickert, Thomas Kurth, Eckhard Wolf, Michele Solimena
Sequential in vivo labeling of insulin secretory granule pools in INS-SNAP transgenic pigs
doi: https://doi.org/10.1073/pnas.2107665118

Link: https://www.pnas.org/content/118/37/e2107665118

Kontakt:

Prof. Dr. Dr. Michele Solimena
Molekulare Diabetologie
DZD-Paul Langerhans Institute des Helmholtz Zentrum München am Universitätsklinikum und der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus der TU Dresden
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