Forschung AG Schubert

In vitro Krankheitsmodellierung in mikrofluidischen Systemen
In Kollaboration mit dem Fraunhofer IWS (Dr. F. Sonntag)
https://www.iws.fraunhofer.de/de/technologiefelder/additive-fertigung-und-oberflaechentechnik/mikro-biosystemtechnik.html)

Kontakt: Dr. Mario Schubert, Prof. Dr. Kaomei Guan
Mitarbeiter: Dr. Mario Schubert, B.Sc. Oliver Gamm

In diesem Projekt haben wir in Kollaboration mit dem Fraunhofer IWS mikrophysiologische Zellkulturchips für die Kultivierung von aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen differenzierten Kardiomyozyten (iPS-Kardiomyozyten) etabliert. Die Zellkulturchips bilden dabei ein geschlossenes System, in dem das Kulturmedium durch integrierte Mikropumpen zirkuliert. Eine komplexe Steuerung ermöglicht nicht nur die Regulierung der Flussraten, sondern ebenso der Sauerstofflevel in der Kulturkammer der iPS-Kardiomyozyten. Während der Kultivierung können die iPS-Kardiomyozyten mittels Durchlicht- sowie Fluoreszenzmikroskopie dokumentiert und so beispielsweise mittels High-Speed-Imaging die kontraktile Funktion charakterisiert werden. So können wir komplexe biologische Vorgänge rekapitulieren und pathophysiologische Szenarien in vitro nachbilden. Unser aktueller Fokus liegt in der Simulation eines akuten Myokardinfarktes und der damit verbundenen Hypoxie-Reperfusionsschädigung der Kardiomyozyten.

Abbildung 1: Mikrophysiologisches System (MPS) zur Kultivierung von iPS-Kardiomyozyten und zur Modellierung pathologischer Zustände. A, B, Aufbau des MPS Chips in Support (A) und Detaildarstellung der Zellkulturkammer (B) mit semipermeabler Membran, Mediumfluss und Induzierung hämodynamischer Stimulation. C, Regulation des Sauerstoffgehalts im Kulturmedium zur Modellierung hypoxischer Zustände. D, Video-basierte Analyse der Kardiomyozytenfunktion im MPS anhand der Kontraktionsbewegungen (Kolanowski et al., 2020).

Interaktion von Kardiomyozyten und kardialer Fibroblasten in Entwicklung und Pathophysiologie
Ehemals gefördert durch MeDDrive Grant der TU Dresden (zu Dr. M. Schubert)

Kontakt: Dr. Mario Schubert, Prof. Dr. Kaomei Guan
Mitarbeiter: Wilhelm Wenke, Paul Josef Conrad Beck, Marcel Hasse

Kardiale Fibroblasten nehmen eine maßgebliche Rolle für physiologische und pathophysiologische Prozesse im Herzen ein, beispielsweise im Rahmen der Herzentwicklung oder der Ausbildung kardialer Fibrose. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen der Zell-Zell-Interaktion zwischen verschiedenen Zelltypen des Herzens sind bislang nur unzureichend erforscht. Eine bessere Kenntnis auf diesem Gebiet könnte jedoch sehr wahrscheinlich neue Ansätze zur Entwicklung neuer Therapien und Identifizierung neuer pharmakologischer Zielstrukturen liefern. Aus diesem Grund beschäftigen wir uns mit der Wechselwirkung humaner iPS-Kardiomyozyten und kardialer Fibroblasten. In unseren Studien kommen sowohl 2D-Zellkulturmodelle als auch 3D-Gewebesysteme, Engineered Heat Tissues oder kardiale Organoide, mit mehreren kardialen Zelltypen (Kardiomyozyten, Fibroblasten, Endothelzellen) zum Einsatz. Die Herstellung von Engineered Heart Tissues als Herzgewebemodell aus iPS-Kardiomyozyten und humanen ventrikulären Fibroblasten ermöglich es uns beispielsweise, die Entstehung von Fibrose und deren Auswirkung auf die Gewebefunktion zu untersuchen.

Abbildung 2: Untersuchung der Kardiomyozyten-Fibroblasten Interaktion. A, B, Der bidirektionale Crosstalk beider Zelltypen finden durch parakrine Signalwege (A), durch die Sezernierung von löslicher Faktoren oder extrazellulärer Matrix, oder durch direkte Zell-Zell-Kontakte (B) statt. C, D, Diese Zell-Zell-Interaktionen untersuchen wir beispielsweise in Engineered Heart Tissues, kleine Muskelringe, die mittels Kollagenmatrices geformt und auf Stretchern kultiviert werden (C). Diese Gewebe ermöglichen sowohl molekulare Analysen der Protein- und Genexpression, als auch die Messungen der Kontraktionskraft unter pharmakologischer Stimulation (D).  

Maturierung von iPS-Kardiomyozyten in 2D und 3D Modellen für Wirkstofftestung und Krankheitsmodellierung
Ehemals gefördert durch MeDDrive Start der TU Dresden (zu Dr. M. Schubert)

Kontakt: Dr. Mario Schubert, Prof. Dr. Kaomei Guan
Mitarbeiter: Paul Josef Conrad Beck, Robert-Patrick Steiner

Eine wesentliche Limitierung bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe stellt die mangelnde Translationsfähigkeit prä-klinischer Therapiekonzepte aus Mausmodellen hin zur klinischen Anwendung im Patienten dar. Die Etablierung humaner Modellsysteme ist daher ein Schlüsselbaustein für zukünftige Arzneimittelentwicklung und zur Reduktion von Tierversuchen. Die Herstellung humaner Kardiomyozyten durch kardiale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Kardiomyozyten) liefert große Mengen humaner Herzmuskelzellen als Modellsysteme für biomedizinische Forschung und Wirkstoffscreenings. Eine Limitation im Hinblick auf das translationale Potential stellt jedoch der embryonale, unreife Phänotyp der iPS-Kardiomyozyten dar welcher die Risikoevaluation kardiotoxischer oder arrhythmogener Wirkstoffe sowie die Etablierung von in vitro Krankheitsmodellen erschwert. Der Fokus in diesem Projekt liegt darauf, die iPS-Kardiomyozyten im Hinblick auf deren Funktionalität, Stoffwechsel und Zellstruktur so zu reifen, dass sie den Eigenschaften adulter Herzmuskelzellen rekapitulieren. Dazu werden iPS-Kardiomyozyten in 2D- und 3D-Zellmodellen in Gegenwart verschiedener Stimuli kultiviert und die Zellen funktionell, metabolisch und strukturell charakterisiert.

Methoden:

• Differenzierung von iPS-Kardiomyozyten

• Genom-Editierung mittels CRISPR-Cas9 Technologie

• Expressionsanalysen (Real-Time PCR, Western Blot, Immunfärbungen)

• Fluoreszenzmikroskopie

• Durchflusszytometrie

• Seahorse-Assays

• Video-basierte Kontraktionsanalyse

• Kultivierung und Charakterisierung von Engineered Heart Tissues

• Lebendzell-Fluoreszenzmikroskopie (Calciumtransienten, Sparks, Aktionspotentiale)

• Mikrophysiologisches Zellkultursystem (Kollaboration Fraunhofer IWS)

Mitarbeiter:innen

Dr. Mario Schubert – Arbeitsgruppenleiter
            Telefon: +49 351 458 6421
            Email:

Paul Beck – MD Student
Philipp Hartmann – MD Student
Marcel Hasse – MD Student/SHK
Wilhelm Wenke – MD Student
Oliver Gamm – Masterstudent
Robert-Patrick Steiner – MD Student
Sinah Hansen – MD Studentin