Hochauflösende 3D-Mikroskopie ermöglicht die Rekonstruktion der Schnellstraßen des Insulintrans­ports

Mikrotubuli sind ein Teil des Zytoskeletts und fungieren als Verbindungswege für den Transport von unterschiedlichen Arten von „Fracht“ innerhalb der Zelle. Ihre Rolle beim Insulintransport und der Insulinausschüttung wird jedoch derzeit diskutiert. Nun hat ein internationales Team angeführt von Wissenschaftlern des Paul-Langerhans-Instituts Dresden, einem Partner des Deutschen Zentrums für Diabetesforschung (DZD), zusammen mit dem CSBD, dem MPI-CBG, dem Janelia Research Campus, dem CMCB, dem Human Technopole und der EPFL mit Hilfe hochauflösender 3D-Elektronenmikroskopie die Insulin-sezernierenden pankreatischen Betazellen der Bauchspeicheldrüse in ihrer Gesamtheit mit einer bisher unerreichten Auflösung abgebildet. Dabei rekonstruierten die Wissenschaftler alle Insulingranula, Mikrotubuli, Mitochondrien, Golgi Apparate und Zentriolen, um eine umfassende räumliche Darstellung der Mikrotubuli-Organellen-Interaktionen erstellen zu können. Das Ergebnis dieses äußerst kooperativen Projekts wurde jetzt in der renommierten Zeitschrift "Journal of Cell Biology" veröffentlicht.

Insulin ist das blutzuckersenkende Hormon unseres Körpers. Es wird in winzigen Vesikeln, den so genannten Insulingranula, in den Betazellen der Bauchspeicheldrüse gespeichert, und jede Betazelle enthält mehrere tausend dieser Insulingranula. Wenn der Blutzuckerspiegel nach einer Mahlzeit ansteigt, verschmelzen diese Granula mit der Zellmembran der Betazelle und ermöglichen so die Freisetzung von Insulin in den Blutkreislauf. Eine verminderte Insulinausschüttung verursacht Diabetes, die häufigste Stoffwechselkrankheit, welche hunderte Menschen weltweit betrifft.

Alle Zellen, auch die Betazellen, enthalten ein so genanntes Zytoskelett. Ein Teil dieses Zytoskeletts sind Mikrotubuli, dünne Fäden, die als Verbindungswege für den Transport von Vesikeln innerhalb der Zelle dienen können. In Betazellen werden diese Mikrotubuli unter anderem dazu verwendet, die Insulingranula zur Zellmembran zu transportieren, so dass das Insulin freigesetzt werden kann. Jedoch gibt es auch Daten, die darauf hinweisen, dass Mikrotubuli den Insulintransport behindern könnten, insbesondere bei niedrigen Blutzuckerwerten. Bis heute gibt es keine vollständige 3D-Rekonstruktion des Mikrotubuli-Netzwerks in Betazellen und seiner Interaktion mit den insulinsekretorischen Granula. Diese Daten können jedoch entscheidende Informationen darüber liefern, wie die Mikrotubuli zur Regulierung des Insulintransports und der Insulinausschüttung beitragen.

"Mikrotubuli sind winzige Filamente mit einem Durchmesser von nur 25 nm, während Betazellen bis zu tausendmal größer sein können. Eine hohe Auflösung zur Visualisierung der Mikrotubuli mit der großvolumigen Aufnahme einer ganzen Betazelle zu kombinieren, stellt eine große Herausforderung dar und wäre mit lichtmikroskopischen Methoden nicht zu erreichen gewesen. Daher haben wir die Zusammenarbeit mit dem Hess Labor am Janelia Research Campus in den USA gesucht. Die Forschergruppe dort hat eine 3D-Elektronenmikroskopie-Methode (Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM)) weiterentwickelt, die eine Kombination von hoher Auflösung bei gleichzeitiger großvolumiger Abbildung ermöglicht", erklärt Dr. Andreas Müller, Postdoc im Solimena-Labor des Paul-Langerhans-Instituts Dresden und Erstautor der Studie. „Unsere Proben wurden über 4 Wochen durchgängig 24 Stunden pro Tag aufgenommen. Die daraus entstandenen riesigen Datenmengen führten nach monatelanger Annotation zu den ersten dreidimensionalen Rekonstruktionen kompletter Mikrotubuli-Netzwerke in primären Betazellen aus Mäusen. Diese geben nun Aufschluss über die Bedeutung der Mikrotubuli für den Transport der Insulingranula und auch über ihre unterstützende Rolle bei der Insulinsekretion.“

Es gelang den Forschern sowohl alle Mikrotubuli als auch Organellen wie die Insulingranula, die Mitochondrien, die Zentriolen, die Zellkerne, den Golgi-Apparat und die Plasmamembranen von 7 kompletten Betazellen (3 unter Niedrigzuckerbedingungen - und 4 unter hohen Zuckerbedingungen) zu rekonstruieren. "In vielen Zellen entspringen Mikrotubuli aus kleinen Strukturen in der Mitte der Zelle, den Zentriolen, und bilden ein radiales Netzwerk, das mit den Speichen eines Fahrradrades vergleichbar ist. Das Betazell-Mikrotubuli-Netzwerk unterscheidet sich sehr stark davon. Es wird vermutet, dass in Betazellen viele der Mikrotubuli aus dem Golgi-Apparat stammen. Wir konnten nun zeigen, dass nur eine sehr geringe Anzahl der Mikrotubuli mit den Zentriolen oder dem Golgi-Apparat verbunden sind, während die meisten Mikrotubuli frei in der Zelle positioniert zu sein scheinen und auf den ersten Blick ein chaotisches Netzwerk bilden", fasst Andreas Müller die Ergebnisse der Studie zusammen. "Unsere detaillierte 3D-Analyse zeigte überraschenderweise, dass unter sowohl unter niedriger als auch hoher Glukosekonzentration sowohl die Mikrotubuli als auch die Insulinranula nahe der Zellmembran angeordnet waren. In allen untersuchten Zellen befanden sich Granula und Mikrotubuli in unmittelbarer Nähe und waren oft direkt miteinander verbunden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass Mikrotubuli dazu beitragen, eine große Menge freisetzbares Insulin in der Nähe der Zellmembran zu positionieren, auch wenn die Zelle nicht mit einer hohe Glukosekonzentration stimuliert wird.”

"Eine weitere Besonderheit unserer Studie ist ihre Datenzugänglichkeit", sagt Deborah Schmidt, Wissenschaftlerin am Zentrum für Systembiologie Dresden und Koautorin der Publikation. "Um die Navigation in unseren digitalen Ergebnissen zu erleichtern, haben wir ein Plugin für die Open-Source-Software FIJI entwickelt. Dieses erlaubt die gemeinsame Betrachtung von Rohvolumen- und Organelle-Segmentierungsmasken (inklusive der dazugehörigen Eigenschaften) und ermöglicht damit einen einfachen und intuitiven Zugang zu den Daten. "Ausserdem ist ein großer Datensatz mit mehreren Betazellen über die Open-Access-Plattform "openorganelle" verfügbar, welches es erlaubt, es zu durchsuchen, herunterzuladen und mit Kooperationspartnern zu teilen, um neben Mikrotubuli auch noch weitere Einblicke in Betazellen zu gewinnen", ergänzt Andreas Müller.

Links

Segmentierungsmasken und Ausschnitte von analysierten Betazellen:
https://cloud.mpi-cbg.de/index.php/s/UJopHTRuh6f4wR8.

FIJI Plugin BetaSeg Viewer:
https://sites.imagej.net/betaseg

Betazellvolumen in voller Auflösung zum Browsen:
https://openorganelle.janelia.org/

Originalpublikation:

Müller A, Schmidt D, Shan Xu C, Pang S, Verner D’Costa J, Kretschmar S, Münster C, Kurth T, Jug F, Weigert M, Hess HF, Solimena M., Three-dimensional Fib-Sem reconstruction of microtubule-organelle interaction in whole primary mouse beta cells. https://doi.org/10.1083/jcb.202010039
Journal of Cell Biology Article